標簽：Western ELISA 山羊抗兔Ig 二抗 抗體  IHC 辣根過氧化物酶標記


　　辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)

　　來源：Goat

　　用途：WB, ELISA, IHC

　　WB：1:1000

　　ELISA：1:250

　　IHC：1:50

　　WB, Western blot; ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IHC, Immunohistochemistry.

　　本辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L))為進口分裝，用于Western、ELISA和IHC等的二抗。HRP，即horseradish peroxidase，中文名為辣根過氧化物酶，可以在Western檢測時催化ECL類試劑(如ECL、BeyoECL等)產(chǎn)生化學發(fā)光，可以在ELISA時催化TMB產(chǎn)生藍色，也可以在IHC或Western blot檢測時催化DAB產(chǎn)生棕色沉淀。

　　本辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)用于WB、ELISA和IHC的推薦稀釋比例參考上表，實際實驗操作過程中需根據(jù)抗原和抗體的具體情況適當調(diào)節(jié)二抗的稀釋比例。對于WB，推薦的稀釋范圍為1:500-2000。

　　本抗體為用純化的兔IgG免疫山羊，然后用親和純化柱對獲得的抗血清進行純化而獲得的二抗。

　　本抗體如果用于常規(guī)的Western檢測，以每次檢測需10毫升1:1000稀釋的二抗計，至少可以檢測100次。

　　山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記操作步驟：

　　(一)獲得目的基因

　　1、通過PCR方法:以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板,按基因序列設(shè)計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),PCR循環(huán)獲得所需基因片段。

　　2、通過RT-PCR方法:用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,以mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。

　　(二)構(gòu)建重組表達載體

　　1、山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)載體酶切:將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切,酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　　2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

　　(三) 獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種

　　1、 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。

　　2、 測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆,重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

　　3、 以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞。

　　(四)誘導表達

　　1、 山羊抗兔IgG(H+L),辣根過氧化物酶標記(Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),HRP Conjug)挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2ml LB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng)。

　　2、按1∶50比例稀釋過夜菌,一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中, 37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,大約需3hr)。

　　3、取部分液體作為未誘導的對照組,余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。

　　4、分別取菌體1ml, 離心12000g×30s收獲沉淀,用100μl 1%SDS重懸,混勻, 70℃10min。

　　5、離心12000g×1min,取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。

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