本生闡述：單克隆抗體的制備實驗需注意問題

　　由于制備單克隆抗體的實驗周期長，環(huán)節(jié)多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。

　　其主要失敗原因和影響因素有：

　　1、污染

　　包括細(xì)菌、霉菌和支原體的污染。這是單克隆抗體制備工作中較辣手的問題。一旦發(fā)現(xiàn)有霉菌污染就應(yīng)及早將污染板棄之，以免污染整個培養(yǎng)環(huán)境。支原體的污染主要來源于牛血清，此外，其它添加劑、實驗室工作人員及環(huán)境也可能造成支原體污染。在有條件的實驗室，要對每一批小牛血清和長期傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系進(jìn)行支原體的檢查，查出污染源應(yīng)及時采取措施處理。對于污染的雜交瘤細(xì)胞可以采取生物學(xué)的過濾方法，將污染的雜交瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待長出腹水或?qū)嶓w瘤時，取出分離雜交瘤細(xì)胞，一般可除去支原體污染。

　　2、融合后雜交瘤不生長

　　在保證融合技術(shù)沒有問題的前提下主要考慮下列因素：

　　(1)牛血清的質(zhì)量太差，用前沒有進(jìn)行嚴(yán)格篩選;

　　(2)HAT有問題，主要是A含量過高或HT含量不足;

　　(3)骨髓瘤細(xì)胞污染了支原體;

　　(4)EG有毒性或作用時間過長。

　　3、雜交瘤細(xì)胞不分泌抗體或停止分泌抗體

　　融合后有細(xì)胞生長，但無抗體產(chǎn)生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生突變，變成A抵抗細(xì)胞所致。有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。對于原分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞變?yōu)殛幮?，可能是?xì)胞支原體污染，或非抗體分泌細(xì)胞克隆競爭性生長，從而抑制了抗體分泌細(xì)胞的生長。也可能發(fā)生染色體丟失。之前提出的“三要"“三不要"，可能是防止抗體停止分泌的有效措施。

　　三要：

　　要大量保持和補充液氮凍存的細(xì)胞原管。

　　要應(yīng)用倒置顯微鏡經(jīng)常檢查細(xì)胞的生長狀況。

　　要定期進(jìn)行再克隆。

　　三不要：

　　不要讓細(xì)胞“過度生長"。因為非分泌的雜交瘤細(xì)胞將成為優(yōu)勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞。

　　不要讓培養(yǎng)物不加檢查地任其連續(xù)培養(yǎng)幾周或幾個月。

　　不要不經(jīng)克隆化而使雜交瘤在機體內(nèi)以腫瘤生長形式連續(xù)傳好幾代。

　　4、雜交瘤細(xì)胞難以克隆化

　　可能與小牛血清質(zhì)量、雜交瘤細(xì)胞的活性狀態(tài)有關(guān)，或由于細(xì)胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應(yīng)在培養(yǎng)液加HT。

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